c81 - Culture tri-compartiment?e de neurones, de cellules gliales et de k?ratinocytes?: mise en ?vidence de contacts cellulaires
Y?Chateau?(1), G?Dorange?(1), JF?Cl?ment?(1), N?Rougier?(1), L?Misery?(1)
(1)Institut de Synergie des Sciences et de la Sant?, Groupe Hospitalier Piti?-Salp?tri?re, Paris.
Mots cl?s : K?ratinocyte (coculture avec neurones).
Introduction
Le r?le du syst?me nerveux en physiopathologie cutan?e est tr?s important [1], mais il n'existe pas de mod?le in vitro permettant de l'?tudier. L'objet de notre ?tude ?tait donc de mettre au point une co-culture de k?ratinocytes et de neurones.
Mat?riels et m?thodes
Pour cela, nous avons utilis? des bo?tes ? domaines s?par?s. Dans la premi?re partie de ces bo?tes, nous avons introduit une suspension cellulaire de k?ratinocytes (4 millions de cellules/ml) obtenus ? partir de biopsie de peau humaine. Le domaine central ?tait ensemenc? avec des neurones sensoriels issus des ganglions des racines dorsales de rat. Le dernier territoire ?tait occup? par des neurones de la corne dorsale de la mo?lle ?pini?re (si?ge du versant sensitif). L'ensemble des cellules ?tait obtenu par dissociation enzymatique puis m?canique Les neurones sensoriels ?taient cultiv?s en faible densit? (500 cellules/bo?te), ce qui n?cessitait l'utilisation d'une lamelle de glie nourrici?re provenant de la sub-culture de mo?lle ?pini?re, et d'un milieu conditionn? par des astrocytes. Apr?s 15 jours de d?veloppement de la co-culture, les cellules ?taient fix?es et nous avons r?alis? des immunomarquages du PGP 9.5 (marqueur sp?cifique des neurones), de la GFAP (cellules gliales), de A2B5 (oligodendrocytes) et de la k?ratine, ainsi qu'un marquage des noyaux cellulaires par le iodure de propidium. Les bo?tes de culture ?taient observ?es en microscopie confocale.
R?sultats
Nous avons ainsi obtenu une co-culture avec trois territoires identifiables. Les k?ratinocytes se groupaient en amas d'une cinquantaine de cellules, constituant un ?quivalent ?pidermique. Les neurones se groupaient aussi en amas, et la pr?sence entre chaque groupe de cellules d'un r?seau tr?s dense de fibres nerveuses permettait de les diff?rencier ais?ment des k?ratinocytes. Ils formaient alors un ?quivalent du ganglion sensitif. Les cellules gliales y ?taient peu nombreuses et environ 20?% d'entre elles ?taient des oligodendrocytes ou cellules de Schwann. Dans l'?quivalent de mo?lle ?pini?re, seules quelques cellules ?taient marqu?es par l'anticorps anti-PGP9.5, sans constitution d'amas, alors que les cellules gliales ?taient beaucoup plus nombreuses (dont environ 20?% d'oligodendrocytes). Les fibres nerveuses issues du territoire des neurones sensoriels se dirigaient sp?cifiquement en direction des k?ratinocytes puis allaient d'amas en amas de k?ratinocytes de mani?re tr?s sp?cifique. De m?me, des fibres ?taient visibles en direction de l'?quivalent de mo?lle ?pini?re. A plus fort grossissement, on observait des zones de superposition des marquages k?ratinocytaires et neuronaux, correspondant ? des zones de contact entre les deux types cellulaires.
Commentaires
Ce mod?le permet donc de reconstituer in vitro un ?quivalent des nerfs sensitifs, connect? d'une part ? un ?quivalent de mo?lle ?pini?re et d'autre part ? un ?quivalent ?pidermique. Nous avons pu observer des contacts entre neurones et k?ratinocytes, similaires ? ceux qui existent in vivo [2]. Un tel mod?le pourrait ?tre utilis? afin d'?tudier les interactions des k?ratinocytes et des fibres nerveuses dans les circonstances physiologiques ou pathologiques (en utilisant des k?ratinocytes issus de malades). Il pourrait constituer un mod?le commode pour ?valuer les effets de l'environnement (ultra-violets, m?dicaments, cosm?tiques), sur les interactions neuro-?pidermiques.
[1] Misery L. Skin, immunity and the nervous system. Br J Dermatol 1997?; 137?: 843-50.
[2] Hilliges M, Wang L, Johansson O. Ultrastructural evidence for nerve fibers within all vital layers of the human epidermis. J Invest Dermatol 1994?; 104?: 134-7.
